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復雜注射劑之脂質體的表征與解決方案
納米脂質體 (nanoliposomes) 是一種具有類細胞膜磷脂雙分子層的納米囊泡體，因為磷脂層與細胞膜的結構類似，可以與細胞膜融合，從而將藥物送入細胞核中。脂質體載體的釋藥機制，使其不但可以增加藥物溶解度，還具有潛在的緩釋或靶向特性，廣受研發人員的青睞，全球范圍內已有 10 余種注射用脂質體產品獲批上市。
納米藥物與其他藥物一樣，必須具有安全性、可控性與有效性，有效性是納米藥物實現疾病治療的基礎。脂質納米注射劑經給藥在體內運轉時，需要克服多重生理/病理屏障，才能安全到達靶點發揮治療作用，在發揮其藥效前需要克服血液、組織、細胞和細胞器等多重屏障。[1]通過調控納米藥物本身的物理化學性質，如納米藥物的大小、形狀、表面電荷等，一定程度上能夠克服藥物遞送障礙。[2]
相比于傳統注射劑，脂質體具有靶向作用，可減輕藥物的毒副作用，機體器官對不同粒徑微粒的阻留能力不同，可通過脂質體注射劑的粒徑控制實現藥物被動靶向效果。[3]脂質體粒徑小于50nm時一般都能夠靶向至脾組織；在50~100nm時能靶向至肝組織；在0.1~0.2μm時能夠靶向至肝組織肝巨噬細胞的溶酶體；在7~12μm時可被肺組織細胞攝取；＞12μm時能夠被毛細血管上皮細胞攝取進而到達荷瘤組織內；＞15μm時能被腸系膜動脈等血管上皮細胞攝取[4]。
脂質體的粒徑直接影響藥物的釋放、生物利用度、載藥量、靶向性等，在制備時應控制粒子的大小，獲得較窄且均勻的粒度分布。
| 奧法美嘉平臺提供整套的脂質體的表征及 解決方案，可用于快速評估、優化脂質體的配 方和工藝：PSI高壓微射流均質機對脂質體進行 制備和粒徑控制、Nicomp粒度分析儀分析平均 粒徑及Zeta電位的檢測、AccuSizer顆粒計數器 分析大粒子濃度，Lumispoc顆粒計數器分析小粒子濃度、Lum穩定性分析儀快速分析脂質體的 穩定性，Entegris-ANOW濾芯過濾雜質及大顆粒。 |
在脂質體的制備方法中有多種制備方法，傳統的方法如：薄膜水化法、溶劑注入法、逆向蒸發法等。這些方法幾乎都是先將脂質溶解在有機溶劑中，然后再去除有機溶劑。另外，也有大量的非傳統制備方法用于研究，如超臨界流體(supercritical fluid, SCF)、微流體技術、冷凍干燥法。此處，介紹一種脂質體的制備流程，見圖1，通過傳統方法制備粒徑比較大的粗脂質體，在除去有機溶劑后，再通過微射流均質的方式進一步降低粒徑及進行整粒；而后通過超濾進行純化，得到粒徑均一、滿足使用安全要求的脂質體。脂質體的平均粒徑和粒度分布是脂質體藥品關鍵質量特性，顯著影響其體內行為。溶解磷脂可能需要用到毒性比較大的有機溶劑，溶劑殘留需要符合ICH相關規定，除去可能存在困難。超濾是影響粒徑和溶劑殘留的關鍵工藝，也是達到控制的最后一步工藝。[5]
圖1 脂質體制備與表征流程圖
脂質體粒度控制
脂質體給藥系統屬于非均相熱力學不穩定系統，脂質體在制備過程中，若粒徑大小及分布不合格，則會影響產品 后續質量問題。粗脂質粒需要經過高壓均質或微射流進行整粒，而后進行超濾純化，得到粒徑均一的脂質體。高壓微 射流均質機具有大規模、連續化生產等特點，通過高速撞擊、剪切與空穴作用達到均質與細化的目的，現已有用于制 備阿糖苷、中鏈脂肪酸、茶多酚及維生素C等納米脂質體的實例。[6]
高壓微射流均質機
PSI-20高壓微射流均質機（小試兼中試型）采用固定 結構的均質腔，通過電液傳動的增壓器使物料在高壓作 用下以極大的速度流經交互容腔的微管通道，物料流在 此過程中受到高剪切力、高碰撞力、空穴效應等物理作 用，使得平均粒徑降低、體系均一穩定，由此獲得理想 的均質、分散、去團聚的結果。
● 最高2069 bar的均質壓力，最高處理量20L/h （PSI- 20） ● 采用特殊設計Y型腔，去除尾端大顆粒效果佳，物料 的混合更均一，處理效率高。 ● 屏顯界面，數據可溯源：支持數據導出設定壓力及實 時壓力、監測點溫度、實時流量、時間等。 ● 配置K型熱電偶：可用于實施監測料液溫度。 ● 低噪音：運行音量低于70分貝，工作環境友好型。 |
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脂質體理化性質評價通常包括粒徑大小及分布均勻程度、穩定性及包封率等方面。粒徑大小及分布除與其包封率及穩定性有關外，同時對載藥脂質體的治療效果有直接的影響。因物理和生理作用，機體能夠選擇性地在肝、脾、肺、淋巴等部位聚集不同大小的載藥脂質體，從而使其釋放藥物發揮藥效。[7]此外，還可以通過檢測Zeta電位對脂質體穩定性進行評價，Zeta電位越高，體系更加穩定。
Nicomp納米激光粒度儀系列 Nicomp系列納米激光粒度儀采用動態光散射原理檢測分析樣品的粒度分布，基于多普勒電泳光散射原理檢測ZETA電位。
l 粒徑檢測范圍0.3nm-10μm，ZETA電位檢測范圍為+/-500mV l 搭載Nicomp多峰算法，可以實時切換成多峰分布觀察各部分的粒徑。 l 高分辨率的納米檢測，Nicomp納米激光粒度儀對于小于10nm的粒子仍然現實較好的分辨率和準確度。 |
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采用GMV(giant multilamellar vesicle)：Sugar-doped lipidfilm hydration（脂膜水化反法）方式制備脂質體，對過濾 擠出工藝前后樣本脂質體用Nicomp 3000設備進行粒度檢 測，測試結果如表1所示。
| Before Extrusion | After Extrusion through 0.4μm Filter (3 times) |
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| After Extrusion through 0.2μm Filter (3 times) | After Extrusion through 0.1μm Filter (3 times) |
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表1 GMV法制備脂質體過濾前后粒徑分布圖（Gaussian 分布）
由表1可知，沒有過濾擠出前Gaussian分布下平均體積徑為1237nm；經過0.4μm、0.2μm、0.1μm過濾器過濾擠出3次后，平均體積徑為219nm、161nm、101nm；平均粒徑明顯降低。其Nicomp 分布如表2所示。通過Nicomp分布可真實反映脂質體粒徑分布情況，由表2中可知，未擠出脂質體體積粒徑Nicomp分布有三個峰；經過0.4μm過濾器擠出后三個峰的粒徑均減小，經過0.2μm過濾器過濾之后變為單峰，經過0.1μm過濾器過濾之后獲得分布更加窄的單峰。
Before Extrusion | After Extrusion through 0.4μm Filter (3 times) |
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| After Extrusion through 0.2μm Filter (3 times) | After Extrusion through 0.1μm Filter (3 times) |
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表2 GMV法制備脂質體過濾前后粒徑分布圖（Nicomp 分布）
對比Gaussian及Nicomp分布結果可知：Gaussian分布可整體反應脂質體粒徑分布情況；而Nicomp分布更真實反映脂質體粒徑分布。通過Nicomp數據的分析可以更好的幫助脂質體制備工藝的優化，選擇合適的處理方式得到想要的粒徑范圍樣本。
用作載藥功能的脂質體平均粒徑一般為亞微米級別或納米級別，但仍存在微米級別的脂質體粒子，尾端大顆粒的存在往往會吸附小顆粒，影響脂質體的穩定性，分析尾端大粒子濃度和數量可以評價當前配方和工藝的情況并做出相應優化，例如用作佐劑的脂質體一般檢測0.8μm~10μm之間的大顆粒分布，以確保工藝的穩定。為確保納米藥物的有效性，還需控制小粒子的濃度，過小的脂質體粒子容易被腎臟清除到尿液排出，無法起到治療作用。[8]
AccuSizer顆粒計數器系列 AccuSizer系列在檢測液體中顆粒數量的同時精確檢測顆粒的粒度及粒度分布，通過搭配不同傳感器、進樣器，適配不同的樣本的測試需求，能快速而準確地測量顆粒粒徑以及顆粒數量/濃度。
l 檢測范圍為0.5μm-400μm（可將下限拓展至0.15μm）。 l 0.01μm的超高分辨率，AccuSizer系列具有1024個數據通道，能反映復雜樣品的細微差異，為研發及品控保駕護航。 l 靈敏度高達10PPT級別，即使只有微量的顆粒通過傳感器，也可以精準檢測出來。 |
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AccuSizer系列用于脂質體粒徑檢測案例
采用GMV(giant multilamellar vesicle)：Sugar-doped lipid-film hydration（脂膜水化反法）方式制備脂質體，對過濾擠出 工藝前后樣本脂質體用AccuSizer A7000設備進行粒度檢測，測試結果如表3所示。
| After Centrifugation | After Extrusion through 10.0μm Filter (1 time) |
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| After Extrusion through 5.0μm Filter (1 time) | After Extrusion through 3.0μm Filter (1 time) |
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表3 GMV法制備脂質體過濾擠出后粒徑分布圖
由表3可知，上面藍色譜圖為數量粒徑分布結果，下面紅色譜圖為體積粒徑分布測試結果。分別對制備的脂質體樣品用 10μm、5μm、3μm過濾器過濾，經過10μm、5μm、3μm過濾器的數量粒徑分布比未過濾前濃度更低，但數量粒徑分布 差異不大；觀察體積粒徑分布，可知：經過10μm、5μm過濾器過濾后，體積占比中大于等于10μm顆粒明顯減少；經過 3μm過濾器過濾后，10μm顆粒體積占比進一步減少，且主峰已不在10μm處，尾端大顆粒明顯減少。
穩定性是評估藥物的常規項，脂質體穩定性影響存放時間和有效期，穩定性較差的脂質體會導致藥物療效降低或副作用增加，有的藥物甚至產生有毒物質。控制尾端大粒子數量和濃度能有效提高脂質體的穩定性，此外，粒徑分布較窄的脂質體穩定性也較好。
LUM穩定性分析儀
LumiFuge穩定性分析儀可以直接測量整個樣品的分散體的穩定性，檢測和區分各種不穩定現象，如上浮、絮凝、聚集、聚結、沉降等，通過測量結果可用來開發新的配方和優化現有的配方及工藝。 l 快速、直接測試穩定性，無需稀釋，溫度范圍寬廣 l 可同時測8個樣品，測量及辨別不同的不穩定現象及不穩定性指數 l 加速離心，最高等效2300倍重力加速度 |
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粗脂質體經高壓微射流等設備整粒之后，需經過超濾才能得到最終的脂質體成品。超濾是以壓力為推動力的膜分離技術之一，優點是沒有相轉移，無需添加任何強烈化學物質，可以在低溫下操作，過濾速率較快，便于做無菌處理等。超濾技術的關鍵是濾膜，濾膜有各種不同的類型和規格，綜合考量物理攔截，吸附攔截等效果，選擇適配的濾膜材質用于過濾。
Entegris濾芯
Entegris-Anow是一家高分子微孔膜過濾企業，專業從事MCE、Nylon、PES、PVDF、PTFE等（膜孔徑為0.03μm~10μm）微孔膜的研發及生產，具有二十多年服務與醫藥客戶經驗，并為全球生物制藥、醫療器械、食品飲料、實驗室分析、微電子及工業等領域的客戶提供過濾、分離和凈化解決方案。
Entegris與Anow的結合，引 入Entegris質量管理體系，每一支濾芯都經過嚴格檢查，此外，新建成的CTC驗證中心，為全球客戶提供專業的驗證服務。 |
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參考資料：
[1] 張燦.聚焦納米治療藥物的成藥性[J].藥學進展,2018,42(11):801-803
[2] 王宇馨. 磷酸錳礦化納米藥物及其抑癌作用研究[D].浙江理工大學,2022.
[3] 高諧,丁楊,周建平.脂質納米注射劑的研究與應用前景[J].中國醫藥工業雜志,2019,50(10):1098-1112.
[4] 王富喜,鄧宏圖,王濱.靶向脂質體的藥理學評價[J].現代醫藥衛生,2023,39(01):137-140.
[5] 脂質體關鍵工藝之擠出和超濾
[6] 陳瓊玲,劉紅芝,劉麗,王強.高壓微射流法制備白藜蘆醇納米脂質體[J].核農學報,2015,29(05):916-924.
[7] 王富喜,鄧宏圖,王濱.靶向脂質體的藥理學評價[J].現代醫藥衛生,2023,39(01):137-140.
[8] Fukumura D, Kloepper J, Amoozgar Z, et al. Enhancing cancer immunotherapy using antiangiogenics: opportunities and challenges[J]. Nature Reviews Clinical Oncology, 2018, 15(5):325-340
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